Caractérisation des mécanismes moléculaires liés à p53 régulant l’expression du gène P2RY6.

Le récepteur P2Y[indice inférieur 6] est un récepteur couplé à une protéine G responsable de l’activation de nombreuses voies de signalisation. Dans l’épithélium du côlon, il participe au maintien de l’équilibre hydrique, mais il a été montré que le récepteur P2Y[indice inférieur 6] participait à l’aggravation des symptômes inflammatoires dans la maladie de Crohn ou dans la colite ulcéreuse. Les maladies inflammatoires de l’intestin sont des facteurs pouvant mener au cancer colorectal. En effet, il existe deux types de cancers colorectaux : le cancer sporadique et le cancer associé à la colite qui se différencient notamment par la séquence d’apparition de mutations génétiques. Par exemple, le gène TP53 est muté de façon tardive dans le cancer colorectal sporadique et muté de façon précoce dans le cancer associé à l’inflammation. Puisque le récepteur P2Y[indice inférieur 6] est impliqué dans la création d’un environnement pro-inflammatoire, nous nous sommes intéressés au rôle de p53 sur l’expression du gène P2RY[indice inférieur 6] et avons formulé l’hypothèse suivante : la présence de TP53 mutant va réguler de façon différentielle l’expression du gène P2RY[indice inférieur 6] dans le cancer colorectal. L’objectif général des travaux est le suivant : caractériser les mécanismes moléculaires liés à TP53 régulant l’expression du gène P2RY[indice inférieur 6] dans le cancer colorectal. Les objectifs spécifiques pour ce projet de recherche sont donc : (1) déterminer et caractériser les régions promotrices du gène P2RY[indice inférieur 6] dans les cellules épithéliales intestinales cancéreuses et (2) étudier l’effet de la protéine p53 de type sauvage ou mutée sur l’expression du récepteur P2Y[indice inférieur 6]. Le gène P2RY[indice inférieur 6] code pour 8 variants d’ARN messagers. Les variants 1, 2, 3, 5, 6, 7 et 8 codent pour l’isoforme 1 du récepteur P2Y[indice inférieur 6], forme connue du récepteur. Le variant 9 code pour l’isoforme 2, non caractérisée. Nos travaux ont permis de mettre en évidence l’existence de quatre régions promotrices potentielles du gène P2RY[indice inférieur 6] et la présence du variant 9, codant pour l’isoforme 2 du récepteur P2Y[indice inférieur 6] dans la lignée cellulaire Caco-2. Nous avons également montré que les formes normale et mutée de p53 régulent de façon différentielle l’expression du récepteur P2Y[indice inférieur 6]. Enfin, le rôle de l’isoforme 2 reste à étudier, mais les tests effectués suggèrent qu’elle est activable par l’UDP.

Étude de l'influence du variant d'histone H2A.Z sur l'organisation des nucléosomes aux enhancers liés par le récepteur alpha de l'oestrogène

L'identité et la réactivité cellulaires sont établies, maintenues et modulées grâce à l'orchestration de programmes transcriptionnels spécifiques. Les éléments régulateurs, des régions particulières de la chromatine responsables de l'activation ou de la répression des gènes, sont au coeur de cette opération. Ces dernières années, de nombreuses études ont révélé le rôle central des « enhancers » dans ce processus. En effet, des centaines de milliers « enhancers » seraient éparpillés dans le génome humain, majoritairement dans sa portion non-codante, et contrairement au promoteur, leur activation varierait selon le type ou l'état cellulaire ou en réponse à une stimulation physiologique, pathologique ou environnementale. Les « enhancers » sont, en quelque sorte, des carrefours où transitent une multitude de protéines régulées par les signaux intra- et extra-cellulaires et un dialogue s'établit entre ces diverses protéines et la chromatine. L'identification des « enhancers ainsi qu'une compréhension de leur mode de fonctionnement sont donc cruciales, tant au plan fondamental que clinique. La chromatine joue un rôle indéniable dans l'activité des éléments régulateurs, tant par sa composition que par sa structure, en régulant, entre autres, l'accessibilité de l'ADN. En effet, l'ADN des régions régulatrices est bien souvent masqué par un nucléosome occlusif, lequel doit être déplacé ou évincé afin de permettre la liaison des protéines régulatrices, notamment les facteurs de transcription (FTs). Toutefois, la contribution de la composition de la chromatine à ce processus reste incomprise. Le variant d'histone H2A.Z a été identifié comme une composante de la chromatine aux régions accessibles, dont des « enhancers » potentiels. Toutefois son rôle y est inconnu, bien que des études récentes suggèrent qu'il pourrait jouer un rôle important dans la structure de la chromatine à ces régions. Par ailleurs, un lien étroit existe entre H2A.Z et la voie de signalisation des oestrogènes (notamment la 17-[beta]-estradiol (E2)). Ainsi, H2A.Z est essentiel à l'expression de plusieurs gènes cibles de l'E2. Les effets de l'E2 sont en partie exercés par un FT, le récepteur alpha des oestrogènes (ER[alpha]), lequel se lie à l'ADN suite à son activation, et ce majoritairement à des « enhancers », et permet l'établissement d'un programme transcriptionnel spécifique. Cette thèse vise à définir le rôle d'H2A.Z aux « enhancers », et plus particulièrement son influence sur l'organisation des nucléosomes aux « enhancers » liés par ER[alpha]. D'abord, mes travaux effectués à l'échelle du génome ont démontré qu'H2A.Z n'est présent qu'à certains ER[alpha]-« enhancers » actifs. Cette particularité a fait en sorte que nous avons pu comparer directement les « enhancers » actifs occupés par H2A.Z à ceux non-occupés, afin de mettre en évidence sa relation à l'environnement chromatinien. Étonnamment, il est apparu qu'H2A.Z n'introduit pas une organisation unique ou particulière des nucléosomes aux « enhancers ». Par ailleurs, nos résultats montrent qu'H2A.Z joue un rôle crucial dans la régulation de l'activité des « enhancers ». En effet, nous avons observé que suite à leur activation par l'E2, les « enhancers » occupés par H2A.Z recrutent l'ARN polymérase II (ARNPII) et produisent un transcrit. Ils recrutent également RAD21, une composante du complexe cohésine impliqué, entre autres, dans des interactions chromosomiques entre « enhancers » et promoteurs. De façon intéressante, nous avons mis en évidence que ces trois évènements, connus pour leur importance dans l'activité des « enhancers », sont dépendants d'H2A.Z. Ainsi, la présence d'H2A.Z à l' « enhancer » pourrait permettre un environnement chromatinien favorable à trois aspects clés de l'activité des « enhancers » : la présence de l'ARNPII, la transcription et la formation d'une boucle d'interaction, et par la suite, de par la proximité « enhancer »-promoteur ainsi créée, augmenter la concentration d'ARNPII à proximité du promoteur favorisant l'expression du gène cible. Un tel rôle central d'H2A.Z dans l'activité d' « enhancers » spécifiques pourrait participer à un mécanisme épigénétique ciblé de la régulation de l'expression des gènes.

Potentiel évolutif de l'hirondelle bicolore (Tachycineta bicolor) : plasticité phénotypique et variation génétique dans un contexte d'hétérogénéité environnementale

Les changements environnementaux actuels entrainent des modifications importantes dans les pressions de sélection qui agissent sur les populations naturelles. Cependant, la capacité de réponse des populations à ces modifications et l’importance relative des différents mécanismes comme la plasticité phénotypique et les changements de la composition génétique des populations restent encore trop peu connus. L’objectif général de ma thèse était donc d’évaluer les rôles de la plasticité phénotypique et de la variation génétique sur le potentiel évolutif en population naturelle. Pour ce faire, j’ai utilisé comme modèle d’étude l’Hirondelle bicolore (Tachycineta bicolor), un passereau migrateur qui est suivi dans le Sud du Québec depuis 2004 dans un environnement hétérogène. Dans un premier temps (chapitre 2), j’ai évalué les déterminants environnementaux de la date de ponte et évalué leurs effets à des niveaux individuels et populationnels de plasticité phénotypique. Comme observé chez de nombreuses espèces aviaires, la température avait un effet important sur la synchronisation de la ponte, similaire au niveau individuel et populationnel, avec les dates de ponte plus hâtive lorsque les températures étaient plus chaudes. Par contre, ces relations semblaient contraintes par la densité locale d’hirondelles, considérée dans ce système d’étude comme un indice de la qualité de l’environnement. Plus précisément, les réponses plastiques à la température étaient moins prononcées à faible densité, c’est-à-dire dans les habitats plus contraignants. Ces résultats suggèrent donc que malgré la présence de plasticité phénotypique chez une espèce donnée, son efficacité pour pallier les changements climatiques peut être inégale entre les populations. Dans un deuxième temps (chapitre 3), je me suis intéressée à 4 gènes candidats liés à la phénologie (CLOCK, NPAS2, ADCYAP1 et CREB1) montrant de la variation de type courtes répétitions en tandem, et à leur relation avec deux traits phénologiques, la date de ponte et le temps d’incubation. Ces analyses ont montré plusieurs relations entre la variation observée à ces gènes et celle des traits phénologiques étudiés, dans la plupart des cas en interaction avec des variables environnementales (densité locale, latitude ou température printanière). Par exemple, les femelles avec en moyenne des allèles plus courts au gène CLOCK pondaient plus tôt que celles avec des allèles plus longs, une relation plus marquée à densité locale élevée. Les différents résultats suggèrent l’importance que peuvent prendre les interactions génotype-environnement, qui sont rarement prises en compte dans les études de gènes candidats, et qui pourraient expliquer une partie des résultats discordants entre les celles-ci. Dans un troisième temps (chapitre 4), j’ai vérifié la faisabilité d’une étude en génétique quantitative avec les données récoltées dans le système d’étude utilisée, caractérisé par un fort taux de reproduction hors couple et un faible recrutement des oisillons. Plus précisément, j’ai testé à l’aide de données empiriques et simulées la précision et l’exactitude des estimations d’héritabilité et de corrélations génétiques pour trois types de traits, morphologiques, reproducteurs et d’oisillons. Les résultats suggéraient un manque de précision important pour les traits morphologiques et reproducteurs, de même que des biais considérables lors de l’utilisation du pédigrée social plutôt que du pédigrée génétique. Ces analyses révèlent entre autres l’utilité des simulations pour tester adéquatement la faisabilité d’une étude en génétique quantitative sur une population donnée. Dans une dernière étude (chapitre 5), j’ai documenté les effets de l’hétérogénéité environnementale et de l’utilisation de différentes approches de génétique quantitative sur les prédictions de réponses évolutives en population naturelle. Plus particulièrement, cette étude s’est concentrée sur trois traits morphologiques (masse, longueur de l’aile et du tarse) mesurés à différents moments au cours du développement des oisillons. Les différentes analyses ont montré une sélection plus forte à faible densité locale pour la masse à 12 jours ainsi que des variations dans les composantes de variances phénotypiques selon la qualité de l’environnement (densité locale faible ou élevée) pour la plupart des combinaisons trait-âge étudiées. Il en résultait une tendance à des réponses évolutives prédites plus grandes à faible densité locale. Par contre, les prédictions obtenues avec l’équation du reproducteur et le second théorème de la sélection différaient fréquemment, et contrastaient grandement avec les tendances phénotypiques observées. En somme, les résultats de ma thèse suggèrent que les possibilités d’ajustement aux changements environnementaux par la plasticité phénotypique et d’adaptation par des changements génétiques entre les générations peuvent varier selon l’environnement expérimenté par une population. Mes recherches contribuent à une meilleure compréhension des facteurs et mécanismes influençant la persistance à long terme des populations naturelles face aux modifications dans les pressions de sélection.